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Feb 28, 2024

Flexibel

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4469 (2022) Diesen Artikel zitieren 5548 Zugriffe 5 Zitate 58 Details zu altmetrischen Metriken Ultradünne linsenlose Faserendoskope bieten minimalinvasive Ergebnisse

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4469 (2022) Diesen Artikel zitieren

5548 Zugriffe

5 Zitate

58 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Ultradünne, linsenlose Faserendoskope ermöglichen eine minimalinvasive Untersuchung, funktionieren jedoch meist als starre Endoskope, da eine vorherige Kalibrierung einer Fasersonde erforderlich ist. Darüber hinaus arbeiten die meisten Implementierungen im Fluoreszenzmodus und nicht im markierungsfreien Bildgebungsmodus, was sie für die allgemeine medizinische Diagnose ungeeignet macht. Hier berichten wir über ein vollständig flexibles ultradünnes Faserendoskop, das holographische 3D-Bilder von ungefärbtem Gewebe mit einer räumlichen Auflösung von 0,85 μm aufnimmt. Unter Verwendung eines bloßen Faserbündels mit einem Durchmesser von nur 200 μm entwerfen wir eine linsenlose Fourier-holographische Bildgebungskonfiguration, um schwache Reflexionen von biologischen Geweben selektiv zu erkennen, ein entscheidender Schritt für die markierungsfreie endoskopische Reflexionsbildgebung. Für die kalibrierungsfreie holografische Bildrekonstruktion wurde ein einzigartiger Algorithmus entwickelt, der es uns ermöglicht, unabhängig von der Faserbiegung Bilder durch einen engen und gekrümmten Durchgang zu erstellen. Wir demonstrieren die endoskopische Reflexionsbildgebung von ungefärbtem Rattendarmgewebe, die für herkömmliche Endoskope völlig unsichtbar ist. Das vorgeschlagene Endoskop wird eine genauere und frühere Diagnose als bisher mit minimalen Komplikationen ermöglichen.

Die optische Mikroskopie ist aufgrund ihrer hohen räumlichen Auflösung, molekularen Spezifität und minimalen Invasivität ein wesentliches Werkzeug zum Verständnis der Physiologie lebender Gewebe1. Diese Vorteile sind jedoch unerreichbar, wenn sich Zielobjekte entweder in gekrümmten Passagen oder unter lichtstreuendem Gewebe befinden. Durch die Visualisierung dieser schwer zugänglichen Bereiche haben Endoskope die medizinische Praxis für die Frühdiagnose von Krankheiten revolutioniert. Im letzten Jahrzehnt wurden Endoskope mit mikroskopischer Auflösung für eine genauere und frühere Diagnose entwickelt2,3. Darüber hinaus ist die Nachfrage nach ultradünnen Endoskopen (mit einem Sondendurchmesser deutlich unter 1 mm) stetig gestiegen, um die Beschwerden und Komplikationen zu minimieren, die mit dem Einführen der Endoskopsonde einhergehen3,4,5,6,7.

In der endoskopischen Mikroskopie werden typischerweise verschiedene optische Fasern als dünne und flexible Lichtleitkanäle eingesetzt. Beispielsweise wurde eine einzelne optische Faser verwendet, indem verschiedene Arten von Scangeräten und optischen Elementen an der der Probe zugewandten distalen Seite der Faser angebracht wurden4,8,9,10. In dieser Konfiguration wurden Multiphotonenbildgebung4,9,11,12,13 und optische kohärente Tomographie (OCT)14,15,16 implementiert. Allerdings ist der an der Faser befestigte Scanner oft zu sperrig, um ultradünn zu sein, obwohl der Durchmesser der Faser selbst klein ist. Durch den Einsatz von Bildleitmedien wie kohärenten Faserbündeln kann auf distale Scanner verzichtet werden, wodurch die Endoskopsonde dünner und robuster wird. Einzelne Faserkerne im Bündel werden als Bildpixel verwendet, indem entweder eine Abbildungsoptik an der Spitze des Faserbündels angebracht wird oder ein direkter Kontakt der Faserspitze mit der Probenoberfläche hergestellt wird17,18. In dieser Konfiguration wurde die Weitfeld-Fluoreszenzbildgebungsmodalität für eine schnelle medizinische Diagnose implementiert19,20. Und die konfokale Fluoreszenzbildgebung wurde durch Hochgeschwindigkeitsscannen des Fokus an der proximalen Seite der Faser außerhalb des Objekts entweder mit17,21 oder ohne22 einer distalen Linse realisiert. Ein entscheidender Nachteil dieser Konfiguration ist die Unfähigkeit, markierungsfreie Reflexionsbilder von biologischen Geweben zu erfassen. Eine starke Rückreflexion der Beleuchtung an den Faserkernen fällt genau mit deutlich schwächeren Reflexionssignalen aus den biologischen Geweben zusammen. Dies ist einer der Hauptgründe, warum der Fluoreszenz-Bildgebungsmodus weit verbreitet ist, bei dem die Fluoreszenzemission mithilfe von Farbfiltern vom Rückreflexionsrauschen getrennt werden kann. Da die meisten Fluoreszenzbildgebungsverfahren eine Färbung erfordern, ist ihre Verwendung für die allgemeine klinische Diagnose begrenzt. Eine einfache Lösung für die intrinsische Reflexionsabbildung besteht darin, eine separate Faser für die Beleuchtung einzuführen. Aufgrund des vergrößerten Sondendurchmessers und des geringen räumlichen Auflösungsvermögens, das durch den für die separate Beleuchtung erforderlichen Abstand zwischen Faser und Probe eingeschränkt ist, war dies jedoch nur für die makroskopische Bildgebung anwendbar.

Es wurden verschiedene Arten von linsenlosen Faserendoskopen entwickelt, um die Sondengröße auf den Durchmesser der Faser selbst zu minimieren. Als Bildführungsmedium wurden beispielsweise Multimode-Lichtwellenleiter eingesetzt23,24,25. Sie bieten zahlreiche unabhängige räumliche Modi, die Bildinformationen gleichzeitig übertragen können. Da ihre Flächenmodendichte ein bis zwei Größenordnungen größer ist als die Faserkerndichte im Faserbündel, kann der Sondendurchmesser sogar kleiner sein als der der Faserbündelsonde. Durch die komplexe Modenmischung werden jedoch Bildinformationen verdeckt. Viele aktuelle Studien haben gezeigt, dass die vorherige Kalibrierung einer Multimode-Faser in Form einer Übertragungsmatrix (TM) die Wiederherstellung des Objektbildes ermöglicht23,24,26,27. Dieses Konzept wurde auf die fluoreszenzendoskopische Bildgebung des Gehirns von Mäusen28,29 und die Weitfeld-Reflexionsbildgebung biologischer Gewebe25 angewendet. Der TM-Ansatz wurde auch auf ein Faserbündelendoskop zur Fluoreszenz-27- oder Transmissions-/Reflexionsbildgebung30,31,32 zur Entfernung sowohl von Pixelartefakten als auch der distalen Optik angewendet. Allerdings wurden TM-basierte Endoskope bisher als starre und nicht als flexible Endoskope verwendet28,29, hauptsächlich weil die TM-Kalibrierung ungültig wird, wenn die Fasern beim Einführen gebogen oder verdreht werden. Zur Lösung dieser kritischen Einschränkung wurden mehrere Ansätze eingeführt. Beispielsweise wurde die Speckle-Korrelation aufgrund des Memory-Effekts des Faserbündels verwendet, um Objektbilder ohne vorherige Kenntnis des TM33,34 zu rekonstruieren. Die Rückkopplungsoptimierung der am proximalen Ende gemessenen Zwei-Photonen-Signale ermöglicht den direkten Zugriff auf die Faser TM35, und auf der distalen Seite wird ein virtueller Leitstern verwaltet, um die Faserbiegung dynamisch zu kompensieren36,37. Die Verwendung speziell entwickelter Fasern, die weniger empfindlich auf Biegeverformungen reagieren, wurde vorgeschlagen38,39,40. Diese Studien haben zwar die Machbarkeit bis zu einem gewissen Grad gezeigt, doch angeborene Einschränkungen wie die lange Optimierungszeit, die Vergrößerung der Sondeneinheit, Einschränkungen bei den Biegekonfigurationen und die Schwierigkeit, ideale Fasern herzustellen, verhindern immer noch die Realisierung flexibler Endoskope. Im Wesentlichen erfordern bisherige linsenlose Faserendoskope entweder eine vorherige Kalibrierung oder arbeiten im Fluoreszenzbildgebungsmodus, und ein ideales Endoskop, das alle kritischen Anforderungen erfüllt – Flexibilität, ultradünner Sondendurchmesser, mikroskopische Auflösung und fleckenfreie Bildgebung – muss noch entwickelt werden.

Hier stellen wir ein vollständig flexibles und ultradünnes Faserendoskop vor, das eine hochauflösende holographische Bildgebung von ungefärbtem Gewebe durch einen engen und gebogenen Durchgang durchführen kann. Unsere Endoskopsonde ist einfach ein bloßes Faserbündel ohne an der Spitze befestigte Linse oder Scanner. Daher entspricht der Durchmesser des Endoskops dem des Faserbündels selbst, der in der vorliegenden Studie entweder 200 μm oder 350 μm betrug. Anders als bei einem herkömmlichen Faserbündelendoskop handelt es sich bei den Faserkernen nicht um Bildpixel. Stattdessen wird die Faser in einem beliebigen Abstand von mehr als 400 μm von der Zielprobe platziert. In dieser einzigartigen Konfiguration erfolgt die Beleuchtung einzeln durch jeden Faserkern, die Erkennung erfolgt jedoch über alle anderen Faserkerne. Die von der Probe reflektierten Wellen, die verschwimmen und sich auf die anderen Faserkerne ausbreiten, werden mithilfe einer holographischen Feldmessung gemessen32. Dadurch können wir das Rückreflexionsrauschen vom Beleuchtungskern selektiv blockieren. Da das gemessene holographische Feld die Fourier-Transformation einer Objektfunktion mittels Fresnel-Beugung enthält, nennen wir unsere Methode „Fourier-holographische Endoskopie“. Aufgrund der dynamisch variierenden Phasenverzögerungen von Kern zu Kern in Bezug auf die Biegung und Verdrillung der Fasern kann jedoch aus dem erfassten Feld kein Objektbild rekonstruiert werden. Während die Faser in früheren TM-Ansätzen vor dem Einsetzen kalibriert wurde, haben wir einen Algorithmus entwickelt, der die komplexen Phasenverzögerungen von Kern zu Kern identifizieren und gleichzeitig das beugungsbegrenzte und pixelfreie Objektbild rekonstruieren kann, ohne dass dies erforderlich ist eventuelle vorherige Kalibrierung. Dies ermöglichte uns die Durchführung endoskopischer Bildgebung mit einer beliebigen und variierenden Biegekonfiguration. Für ein Objekt, das sich hinter einem engen und gekrümmten Durchgang befindet, führten wir die endoskopische Reflexionsbildgebung mit einer mikroskopischen räumlichen Auflösung von 0,85 μm für Ziele mit geringer Kontrastauflösung durch. Darüber hinaus haben wir mithilfe der holographischen Bildrekonstruktion eine volumetrische 3D-Bildgebung realisiert, die einen Tiefenbereich von 400–1200 μm mit einer axialen Auflösung von bis zu 14 μm abdeckt. Um die Anwendbarkeit der vorgeschlagenen Methode zur Untersuchung biologischer Proben zu überprüfen, führten wir holographische Fourier-Endoskopaufnahmen von ungefärbtem Rattendarmgewebe durch, das für herkömmliche Endoskope im Reflexionsmodus völlig unsichtbar ist. Wir haben die Abbildung einzelner Zotten mit einer räumlichen Auflösung und einem Kontrast gezeigt, die denen herkömmlicher konfokaler Reflexionsmikroskope ebenbürtig oder sogar besser sind.

Unser Versuchsaufbau ist in Abb. 1a dargestellt. Als Lichtquelle wurde ein Diodenlaser (Finesse Pure, Laser Quantum) mit einer Wellenlänge von λ = 532 nm und einer Kohärenzlänge von 6 mm verwendet. Der Ausgangsstrahl wurde mit einem Strahlteiler (BS1) in Proben- und Referenzwellen aufgeteilt. Der Probenstrahl wurde von einem zweiachsigen Galvanometerspiegel (GM) reflektiert und über eine Objektivlinse (OL) auf die Eingangsebene (IP) eines kohärenten Faserbündels fokussiert. Es wurden zwei Arten von Faserbündeln verwendet, eines mit 350 μm Durchmesser (Fujikura, FIGH-10-350S) und das andere mit 200 μm Durchmesser (Fujikura, FIGH-10-200S). Das Faserbündel mit einem Durchmesser von 350 μm (1 m lang und einem minimalen Biegeradius von 35 mm) enthält etwa 10.000 Faserkerne, deren Durchmesser jeweils etwa 2 μm beträgt. Wir haben den GM-Scanwinkel angepasst, um den Beleuchtungsstrahl nacheinander auf jeden Faserkern zu fokussieren. Dadurch wurde sichergestellt, dass der Beleuchtungsstrahl (grün dargestellt) durch den einzelnen Faserkern wanderte und über denselben Faserkern aus der Ausgangsebene (OP) des Faserbündels austrat.

ein Versuchsaufbau. Der Ausgangsstrahl eines Lasers wird in Proben- und Referenzstrahl aufgeteilt. Der Probenstrahl wird durch das Faserbündel zur Probe geleitet. Das Rückstreusignal der Probe, das zur Verdeutlichung gelb dargestellt ist, obwohl seine Wellenlänge mit der einfallenden Welle identisch ist, wird vom Faserbündel erfasst und an die Kamera weitergeleitet. Der Referenzstrahl erzeugt zusammen mit dem Signalstrahl an der Kamera ein Interferogramm. GM: 2-Achsen-Galvanometer-Scanspiegel, BS1-3: Strahlteiler, L1-5: Linsen, OL: Objektivlinse. IP und OP: Eingangs- bzw. Ausgangsebenen des Faserbündels. SP: Probenebene. b Prinzip der Bilderzeugung. Die Beleuchtungs- und Reflexionswege wurden aufgefaltet, um ihre Unterscheidung deutlich zu machen. \(\left({u}_{i},{v}_{i}\right)\) und \(\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}} }},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\): Raumkoordinaten am Faserbündel für Beleuchtungs- bzw. Detektionspfade; \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}}}}}^{{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{ {{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) und \({\phi } _{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\ rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\): Phasenverzögerungen, die durch das Faserbündel während der Beleuchtung und Reflexion hervorgerufen werden , jeweils; \({E}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\left(x,y\right)\) und \({E}_{{{{{{\rm{ r}}}}}}}\left(x,y\right)\): die auf die Probe einfallenden bzw. von ihr reflektierten elektrischen Felder; und \({E}_{{{{{{\rm{Kamera}}}}}}}\left({u}_{{{{{\rm{r}}}}}}},{ v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\): das an der Kamera erfasste elektrische Feld.

Um das Rückreflexionsrauschen vom Faserbündel zu trennen, haben wir die Probenebene (SP) in einem Abstand d vom OP platziert. Dadurch konnten die Rückstreusignale der Probe im Raum verteilt und an anderen Kernen als dem Beleuchtungskern gesammelt werden. Die Bildauflösung variiert je nach Abstand. Unser System bietet jedoch immer eine bessere räumliche Auflösung als die Kontaktmodus-Bildgebung, deren Auflösung durch den Kerndurchmesser bestimmt wird. Wie später bestätigt wurde, liegt dies daran, dass das Raum-Bandbreiten-Produkt unseres Systems um den Faktor 13 höher ist. Typischerweise lag d im Bereich von 400 bis 1200 μm, um sicherzustellen, dass die Fresnel-Näherung gültig ist (siehe ergänzenden Abschnitt 4 für den minimalen Arbeitsabstand). 41. Bei dieser Anordnung kommt der Beleuchtungsstrahl am OP als parabolische Welle am SP an. Der Winkel der parabolischen Beleuchtungswelle am SP variiert abhängig von der Position des Beleuchtungskerns am IP. Die vom Objekt am SP zurückgestreuten Wellen (gelb dargestellt) werden von mehreren Faserkernen am OP erfasst und an das IP zurückgesendet. Die durch das IP zurückkehrenden Wellen werden vom OL erfasst und an die Kamera übermittelt. Um die Amplitude und Phase der zurückkehrenden Wellen zu erhalten, wurde eine Referenzwelle mit einer außeraxialen Konfiguration an der Kamera eingeführt und die Hilbert-Transformation auf die aufgezeichneten Hologramme angewendet.

Der detaillierte Aufbau des Bilderzeugungsprozesses ist in Abb. 1b dargestellt. Die einfallende Welle konzentriert sich auf den Faserkern bei \(\left({{{{{{\boldsymbol{u}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}} {{{{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{{\boldsymbol{v}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}} \right)\) des IP erfährt eine Phasenverzögerung \({{{{{{\boldsymbol{\phi }}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}}^ {{{{{{\bf{b}}}}}}}\left({{{{{{\boldsymbol{u}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}} }}}}}{{{{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{{\boldsymbol{v}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}} }}}}}\right)\) am entsprechenden Kern und tritt als Punktquelle am OP aus. Diese Punktquelle wandert zum SP und trifft als parabolische Welle auf das Zielobjekt. Die einfallende Welle bei \(\left({{{{{\boldsymbol{x}}}}}}{{{{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{\boldsymbol{y}} }}}}\right)\) des SP kann geschrieben werden als

Dabei ist \(k=2\pi {\lambda }^{-1}\) die Wellenzahl. Die Welle wird von der Zielprobe mit der Objektfunktion \(O\left(x,y\right)\) reflektiert, die dem Amplitudenreflexionsvermögen des Ziels entspricht. Die reflektierte Welle gegeben durch \({E}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\left(x,y{{{{{\rm{;}}}}}}{ u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)=O\left( x,y\right){E}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\left(x,y{{{{{\rm{;}}}}}}{u }_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) ist auf dem abgebildet Die Transmissionsseite der Probe ist in Abb. 1b dargestellt, um sie deutlich von der einfallenden Welle zu unterscheiden. Die reflektierte Welle wandert zurück zu \(\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}} }}}}\right)\) des OP nach der Fresnel-Beugung und kehrt zum IP zurück, nachdem es eine faserkernabhängige Phasenverzögerung erfahren hat \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}} }}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{ {{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\). Nach Einbeziehung aller dieser Prozesse können wir das Feld an der Kamera erhalten, dh das Feld, das an der proximalen Facettenebene der Faser erfasst wird, wie folgt:

Hier ist \({\widetilde{O}}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\) die Fourier-Transformation der modifizierten Objektfunktion \({O}_{{{{ {{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right)=O\left(x,y\right){\exp }\left\{i\frac{k}{d} \left({x}^{2}+{y}^{2}\right)\right\}\) und \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}} }}}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\ rechts)=\frac{k}{2d}\left({{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}}^{2}+{{v}_{{{ {{{\rm{i}}}}}}}}^{2}\right)+{\phi }_{{{{{\rm{i}}}}}}}^{{{{ {{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm {i}}}}}}}\right)\) und \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\left({u}_{{{{ {{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)=\frac{k}{2d}\left( {u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{2}+{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{2 }\right)+{\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u }_{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) sind die Phasenverzögerungen in den Beleuchtungs- bzw. Reflexionspfaden (siehe ergänzender Abschnitt 1 für die detaillierte Ableitung von Gleichung (2)). Im Wesentlichen enthält das gemessene Feld das Objektspektrum mit Skalierungsfaktor k/d und spektraler Verschiebung um \(\left({-u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{- v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\). Die quadratischen Phasenterme werden aufgrund der Fresnel-Beugung eingeführt. Interessanterweise werden sie separat absorbiert in \({O}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right)\), \({\phi }_{ {{{{{\rm{i}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{ {\rm{i}}}}}}}\right)\) und \({\phi }_{{{{{\rm{r}}}}}}}\left({u}_ {{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\).

Finden von \({O}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right)\), \({\phi }_{{{{{{\ rm{i}}}}}}}\left({u}_{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i} }}}}}}\right)\), und \({\phi }_{{{{{\rm{r}}}}}}}\left({u}_{{{{{{ \rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) aus den gemessenen Reflexionswellen ist im Allgemeinen eine schwierige Aufgabe, insbesondere wenn die Phasenverzögerungen zwischen den Kernen unkorreliert sind. Allerdings gilt Gl. (2) entspricht formal der Abbildungskonfiguration, bei der sich das in ein aberrierendes Medium eingebettete Zielobjekt genau in der Brennebene der Objektivlinse befindet42. In unseren früheren Studien42,43,44 haben wir eine Methode namens „Closed-Loop-Akkumulation von Einzelstreuung (CLASS)“ entwickelt, um die Objektfunktion von komplexen probeninduzierten Aberrationen zu trennen und die ideale beugungsbegrenzte räumliche Auflösung wiederherzustellen. Wir haben diesen CLASS-Algorithmus speziell umgestaltet, um das vorliegende Problem zu lösen, indem wir die pixelige Abtastung durch das Faserbündel und die quadratischen Phasenterme berücksichtigen. Das Arbeitsprinzip besteht darin, zunächst die Reflexionsmatrix R zu konstruieren, in der die Elemente mit \({E}_{{{{{{\rm{camera}}}}}}}\left({u}_{{ {{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm {i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) mit \(\left({u}_{{{{ {{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) und \(\left({u}_ {{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) als Spalten- und Zeilenindizes, jeweils. Anschließend berechnen wir iterativ die Korrelationen zwischen den Spalten und Zeilen, um \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\left({u}_{{{{{{ \rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) und \({\phi }_{{{{ {{\rm{r}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm {r}}}}}}}\right)\), woraus wir \({O}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right )\) (Einzelheiten zur Bildrekonstruktion finden Sie unter Methoden). Wir können die Reflexionskarte der Zielprobe durch die einfache Beziehung \({\left|{O}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right) erhalten. \right|}^{2}={\left|O\left(x,y\right)\right|}^{2}\). Dieser Algorithmus identifiziert automatisch \(\frac{k}{d}\left({x}^{2}+{y}^{2}\right)\) in \({O}_{{{{{{ \rm{M}}}}}}}\left(x,y\right)\) für die Objekte im Arbeitsbereich. Da der Faser-zu-Probe-Abstand d automatisch aus den quadratischen Phasentermen ermittelt wird, ist es auch möglich, aus der Aufnahme einer einzelnen Reflexionsmatrix ein 3D-Bild zu rekonstruieren.

Experimentelle Verfahren zur Durchführung der endoskopischen Bildgebung sind in Abb. 2 dargestellt. Wir haben ein Auflösungsziel der US Air Force (USAF) (Edmund, 2″ x 2″ Positiv, 1951 USAF Hi-Resolution Target #58-198) am SP platziert. Das herkömmliche endoskopische Vollfeldbild, das mit demselben Faserbündel aufgenommen wurde, ist in Abb. 2h als Referenzpunkt dargestellt (Einzelheiten siehe Methoden). Anhand des am IP aufgenommenen Fotos der Faserbündeloberfläche haben wir ausgewählt, welche Faserkerne beleuchtet werden sollen (die roten Punkte in Abb. 2a). In einer beliebigen Faserbiegekonfiguration haben wir den GM-Winkel angepasst, um den Beleuchtungsstrahl jeweils auf jeden Kern zu fokussieren. In einem typischen Experiment wurden 100–3000 verschiedene Faserkerne beleuchtet. Rohbilder der am IP aufgenommenen Rückstreuwellen der Probe sind in Abb. 2b für die Beleuchtung einiger repräsentativer Kernfasern dargestellt. Die räumlichen Koordinaten dieser Ausgabebilder entsprechen \(\left({{{{{{\boldsymbol{u}}}}}}}_{{{{{{\bf{r}}}}}}}{ {{{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{{\boldsymbol{v}}}}}}}_{{{{{{\bf{r}}}}}}}\ rechts)\) an der Faserbündeloberfläche. In jedem Bild ist der helle Punkt auf die direkte Rückreflexion vom Faserkern zurückzuführen, auf den die Beleuchtung fokussiert wurde. Sie bewegten sich synchron mit der Abtastung von \(\left({{{{{{\boldsymbol{u}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}}{{ {{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{{\boldsymbol{v}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}}\right )\). Vom Zielobjekt zurückgestreute Signalwellen wurden in den aufgenommenen Bildern räumlich über die anderen Kerne verteilt. Wir haben das Rückreflexionsrauschen selektiv entfernt, indem wir das Signal an dem Pixel abgesenkt haben, wo das Rückreflexionsrauschen fokussiert war. Anschließend haben wir die Hilbert-Transformation an den Rohbildern in Abb. 2b durchgeführt, um eine komplexe Feldkarte der rückgestreuten Wellen zu erhalten (Abb. 2c).

ein Hellfeldbild des Faserbündels, aufgenommen am IP durch Beleuchtung der inkohärenten Quelle vom OP aus. Die Faserkerne, auf die der Beleuchtungsstrahl fokussiert wurde, werden als rote Punkte angezeigt. b Von der Kamera aufgenommene Rohbilder zum Scannen von \(\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm {i}}}}}}}\right)\). Zur besseren Sichtbarkeit wurden die hier gezeigten Bilder ohne Referenzstrahl aufgenommen, während die Interferenzbilder für die endoskopische Bildgebung aufgenommen wurden (Rohinterferenzbilder siehe Ergänzungsabschnitt 2). Der Farbbalken zeigt die normalisierte Intensität ohne Rückreflexionsrauschen an. c Komplexe Feldkarten \({E}_{{{{{{\rm{camera}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}} },{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_ {{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\), erhalten aus den rohen Interferenzbildern in b. Kreisförmige Farbkarte: reale und imaginäre Werte von \({E}_{{{{{{\rm{camera}}}}}}}\). d und e Faserkernabhängige Phasenverzögerungen \({\phi }_{{{{{\rm{i}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{i }}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) und \({\phi }_{{{{{{\rm {r}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}} }}}}}\right)\), bzw. über den Algorithmus identifiziert. Der Farbbalken gibt die Phase im Bogenmaß an. Maßstabsleiste, 0,1k. f und g Das Gleiche wie d bzw. e, jedoch für ein Ziel mit geringer Kontrastauflösung. h Konventionelles endoskopisches Bild eines USAF-Ziels, aufgenommen mit der inkohärenten Beleuchtung des IP. Das Faserbündel hatte Kontakt mit der Zieloberfläche. i Kohärente Addition inverser Fourier-transformierter Bilder der komplexen Feldkarten in c vor der Korrektur der faserkernabhängigen Phasenverzögerungen. j Das Gleiche wie i, jedoch nach der Korrektur. Der Farbbalken gibt die normalisierte Amplitude an. k–m Das Gleiche wie h–j, jedoch für ein Ziel mit geringer Kontrastauflösung. Es wurde ein Faserbündel mit einem Durchmesser von 350 μm verwendet, und der Abstand d von der Faser zur Probe betrug 500 μm für i, j, l und m. Maßstabsbalken in a bis c: 50 μm. Maßstabsbalken in j und m: 30 μm.

Die erfassten Bilder in Abb. 2c entsprechen \({E}_{{{{{\rm{Kamera}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}} }}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}} ,{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) in Gl. (2). Da \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}}}}}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_ {{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) und \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{{{{{{ \rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) variieren beim Einsetzen der Faser das Objektbild erheblich kann aus den Bildern in Abb. 2c nicht direkt rekonstruiert werden. Die inverse Fourier-Transformation der Bilder in Abb. 2c führte zu gesprenkelten Mustern und ihre kohärente Summierung zeigte keine Anzeichen von Bildinformationen (Abb. 2i). Wie bereits beschrieben, haben wir aus den Bildern in Abb. 2c eine Reflexionsmatrix erstellt und unseren Algorithmus angewendet, um \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\left({ u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) und \( {\phi }_{{{{{\rm{r}}}}}}}\left({u}_{{{{{\rm{r}}}}}}},{v} _{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\), die jeweils in Abb. 2d dargestellt sind, z. Sie zeigten erwartungsgemäß komplexe Phasenmuster. Wir haben diese kernabhängigen Phasenverzögerungen der Bilder in Abb. 2c kompensiert, die dann nach Berücksichtigung der spektralen Verschiebung durch (ui, vi) kohärent hinzugefügt wurden (siehe Methoden für den Algorithmus und die Bildrekonstruktion). Das endgültige rekonstruierte Bild in Abb. 2j zeigt feine Details in den Gruppen 8 und 9, die im herkömmlichen Endoskopbild in Abb. 2h unsichtbar waren. Unser Endoskop konnte das kleinste Merkmal des USAF 1951-Ziels im 1. Element der Gruppe 9 mit einem Abstand von 1,56 μm zwischen den benachbarten Balken auflösen. Dies lässt darauf schließen, dass die laterale Auflösung gleich oder besser als 1,56 μm ist. Tatsächlich ist der Rand des USAF-Ziels scharf genug, um die Auflösung des Endoskops vollständig auszuwerten. Durch die Analyse der Kantenreaktionsfunktion stellten wir fest, dass die laterale Auflösung bis zu 0,85 μm betrug, was sehr nahe an der theoretischen Auflösung (0,78 μm) unseres Systems liegt (siehe ergänzender Abschnitt 3). Darüber hinaus gab es keine Pixelierung im rekonstruierten Bild, da die über \({E}_{{{{{\rm{Kamera}}}}}}}\) erfassten Bilder zwar in der Ortsfrequenz, aber nicht in der Realität pixelig waren Raum. Dies führte zu einer Steigerung des Raum-Bandbreiten-Produkts um den Faktor 13 im Vergleich zu herkömmlichen Kontaktmodus-Endoskopen (siehe ergänzender Abschnitt 3).

Die Bildauflösung unseres Endoskops wird durch den Durchmesser des Faserbündels D bestimmt, der die numerische Apertur (NA) durch \(\alpha=n\left(D/2\right){d}^{-1}\ festlegt. ), wobei n der Brechungsindex des Mediums zwischen der Faser und der Probe ist. Wenn \(\alpha\) größer ist als die NA der Faser selbst (0,4), dann begrenzt letztere die erreichbare räumliche Auflösung. Wenn d von 1,2 mm auf 400 μm reduziert wird, erhöht sich \(\alpha\) für n = 1 von 0,12 auf 0,47 und das theoretische räumliche Auflösungsvermögen erhöht sich von 1,6 auf 0,67 μm. Im Experiment wurden aus Rechenzeitgründen die reflektierten Wellen innerhalb des Durchmessers von \({D}_{{{{{\rm{eff}}}}}}}=0,80D\) verwendet. Daher betrug die beugungsbegrenzte Auflösung bei d = 500 μm 0,78 μm, was nahe am experimentellen Ergebnis liegt. Der Sichtfelddurchmesser wurde als \(L=\left(\lambda /n\right)d\Delta {D}^{-1}\) festgelegt, wobei \(\Delta {D}\) = 3,2 μm ist Faserkern-zu-Kern-Abstand. Daher stieg L mit zunehmendem d von 66 μm auf 170 μm. Im Bildrekonstruktionsprozess wurde der effektive Kern-zu-Kern-Abstand auf \(\Delta {D}_{{{{{\rm{eff}}}}}}}\)= 1,5 μm reduziert Synthese mehrerer Bilder mit der spektralen Verschiebung um \(\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i }}}}}}}\Rechts)\). Infolgedessen lag L im Bereich von 140 bis 410 μm mit einem Anstieg von d. Das geschätzte Sichtfeld bei d = 500 μm betrug 170 μm, was gut mit dem experimentellen Ergebnis übereinstimmt (siehe ergänzender Abschnitt 3 für das Auflösungsvermögen und das Sichtfeld für Faserbündel mit 350 μm Durchmesser und 200 μm Durchmesser).

Um den Nutzen unserer Methode bei der Entfernung des Rückreflexionsrauschens zu beweisen, führten wir eine Bildgebung eines kontrastarmen USAF-Auflösungsziels durch (Thorlabs, Positive 1951 USAF-Testziel, R1DS1P). Das Reflexionsvermögen des Ziels war bei einer Wellenlänge von 532 nm 10 % höher als das des Hintergrunds. Die konventionelle endoskopische Bildgebung (Abb. 2k) zeigte überhaupt keine Strukturen, da das Rückreflexionsrauschen viel stärker war als das Rückstreusignal vom Auflösungsziel. Im Gegenteil, unsere Methode konnte die Zielstrukturen deutlich aufdecken (Abb. 2m). Abbildung 2f, g zeigt die identifizierten kernabhängigen Phasenverzögerungen.

Wir demonstrierten die markierungsfreie mikroskopische Bildgebung durch einen schmalen und gekrümmten Durchgang. Ein Zielobjekt wurde in eine Box gelegt und ein 80 cm langes Kunststoffrohr mit einem Loch an der Decke der Box verbunden (Abb. 3a, b). Der Innen- und Außendurchmesser des Rohrs betrugen 4,3 bzw. 6,5 mm. Während das proximale Ende der Faser in der Brennebene der Objektivlinse fixiert war (Einschub in Abb. 3b), wurde die distale Seite der Faser durch das Rohr eingeführt, bis sie das Ziel erreichte (Edmund, 2″ × 2″). Positiv, 1951 USAF Hi-Resolution Target Nr. 58-198). Ein herkömmliches endoskopisches Bild wurde aufgenommen, als das Faserbündel Kontakt mit dem Ziel hatte (Abb. 3c). Obwohl dieses Bild verpixelt war und sein Auflösungsvermögen gering war, ermöglichte es uns, die Faser im interessierenden Bereich zu positionieren. Sobald das Ziel identifiziert war, zogen wir das Faserbündel zurück, um d innerhalb des Arbeitsbereichs einzustellen, und zeichneten durch Scannen der Beleuchtungsfaserkerne eine Reflexionsmatrix auf. Das aufgenommene Bild ist in Abb. 3d dargestellt, in der das rekonstruierte Bild automatisch auf das Zielobjekt fokussiert ist und feine Details der Gruppe 9 mit einer räumlichen Auflösung von 1,1 μm deutlich sichtbar sind. Der Abstand wurde aus der quadratischen Phase des rekonstruierten Bildes mit 800 μm berechnet. Dieses Ergebnis bestätigt, dass unser Endoskop ohne vorherige Kalibrierung des Faserbündels ein mikroskopisches In-situ-Bild eines Zielobjekts durch einen engen und gekrümmten Durchgang aufnehmen kann.

a und b Vorder- bzw. Draufsicht der Versuchsanordnung. Das vergrößerte Bild in a: die distale Seite des Faserbündels in der Nähe der Probe. Das vergrößerte Bild in b: jeweils die Lichteinkopplung in die IP der Faser von der Objektivlinse. c und d Konventionelles endoskopisches Bild bzw. das rekonstruierte Bild mit unserem Endoskop. Maßstabsbalken: 20 μm. Der Farbbalken in c zeigt die normalisierte Intensität und der Farbbalken in d zeigt die normalisierte Amplitude. e Schematische Darstellung der endoskopischen Bildgebung gestapelter Ziele. Zwei Auflösungsziele wurden in zwei unterschiedlichen Tiefen, I und II, mit Abständen von Faser zu Probe von 0,6 bzw. 1,06 mm platziert. Neben dem Schema wurden mit einem konventionellen Hellfeldmikroskop aufgenommene Bodenwahrheitsbilder der Ziele in den Tiefen I und II gezeigt. f und g Endoskopische Bilder für die Tiefen I bzw. II, rekonstruiert unter Verwendung einer einzigen Reflexionsmatrixaufnahme. Für die Bildaufnahme wurde das Faserbündel mit 350 μm Durchmesser verwendet. Maßstabsbalken: 30 μm. Der Farbbalken gibt die normalisierte Amplitude an.

Unser Endoskop verfügt über eine 3D-Bildgebungsfunktion, da unser Algorithmus als holographische Bildrekonstruktion arbeitet. Für die beiden Ziele mit einem Abstand von 460 μm (Abb. 3e) haben wir eine einzelne Reflexionsmatrix verwendet. Unser Algorithmus identifizierte das Zielbild aus Tiefe I (Abb. 3f), da diese Tiefe bei der Berechnung der kernabhängigen Phasenverzögerungen stärkere Korrelationen ergab als Tiefe II. Nachdem ϕi (ui, vi) und ϕr (ur, vr) für die Tiefe I identifiziert worden waren, wendeten wir die rechnerische Ausbreitung jeder E-Kamera (ui, vi; ui, vi) basierend auf der Winkelspektrummethode41 an, nachdem wir die zu erhaltende Korrektur angewendet hatten das Zielbild in der Tiefe II. Nach numerischer Refokussierung kamen völlig andere Strukturen entsprechend der Tiefe II zum Vorschein (Abb. 3g) (siehe Zusatzfilm 1, aufgenommen während die Fokusebene rechnerisch gescannt wurde). Dieses Ergebnis zeigte den volumetrischen Bildbereich, der von einer einzelnen Matrixaufzeichnung abgedeckt wurde. Wir demonstrierten die volumetrische Abbildung von in Agarosegel dispergierten TiO2-Partikeln und bewiesen, dass die Tiefenauflösung unseres Endoskops bis zu 14 μm betrug (siehe Ergänzungsabschnitt 3 und Ergänzungsfilm 2).

Wir haben die endomikroskopische Bildgebung ungefärbter biologischer Gewebe demonstriert. Ein einer Ratte entnommenes Darmgewebe wurde auf einen Objektträger gelegt (siehe Methoden zur Probenvorbereitung). Zunächst wurde die Spitze des Faserbündels nahe an der Oberfläche der Zotten im Darm platziert. Das mit dem herkömmlichen Endoskop aufgenommene Bild ist in Abb. 4a dargestellt, wobei der Kontrast zwischen Ziel und Hintergrund zu gering war, um Zotten zu erkennen. Tatsächlich war der Kontrast der Zotten so gering, dass sie selbst im Transmissionsbild (Abb. 4b), das durch Beleuchtung von der Probenseite aufgenommen wurde, undeutlich sichtbar waren. Anschließend haben wir das Faserbündel etwa 1000 μm von den Zotten entfernt zurückgezogen und endoskopische Bilder für verschiedene Regionen gemacht. Repräsentative Bilder, die für die in Abb. 4b angegebenen Kreisflächen erhalten wurden, sind in Abb. 4c – f dargestellt. Die Grenze der Zotten ist scharf aufgelöst und bietet einen wesentlich besseren Kontrast als das herkömmliche Endoskopbild, und die Strukturen der relativ transparenten inneren Teile in der Nähe der Grenze sind erkennbar. Die gesamte Karte von zwei Zotten wurde durch Zusammenfügen mehrerer für verschiedene Regionen aufgenommener Bilder rekonstruiert (Abb. 4g). Die durch die Schärfe der Grenze erzielte räumliche Auflösung betrug etwa 1 μm und war damit weitaus besser, als eine typische Koloskopie liefern kann. Bei dieser Demonstration war die Reflexion der Glasoberfläche gegenüber derjenigen der Gewebeoberfläche dominant. Daher wurde der Kontrast des rekonstruierten Bildes durch die Reflexion der Glasoberflächentransmission durch das Darmgewebe erzeugt.

a Konventionelles Reflexionsendoskopbild, aufgenommen, als das Faserbündel Kontakt mit den Zotten hatte. b Konventionelles Transmissionsbild, aufgenommen durch das Faserbündel. Die LED-Beleuchtung wurde von den Zotten zum Faserbündel geleitet. Maßstabsbalken: 100 μm. vgl. Markierungsfreie Reflexionsbilder, die mit unserem holographischen Endoskop für die in b angegebenen kreisförmigen Bereiche aufgenommen wurden. Maßstabsbalken: 25 μm. g Rekonstruiertes Bild von zwei Zotten durch Zusammenfügen mehrerer Bilder, die über einen weiten Bereich von Interesse aufgenommen wurden. Für die Bildaufnahme wurde das Faserbündel mit 350 μm Durchmesser verwendet. Maßstabsbalken: 100 μm.

Um die Gewebebildgebung im Vollreflexionsmodus zu demonstrieren, legten wir ein Rattendarmgewebe auf Agarosegel und füllten den Spalt zwischen Gel und Faserbündel mit Wasser (Abb. 5a). Die Brechungsindizes von Wasser und Agarosegel waren nahezu identisch, sodass die Reflexion an ihrer Grenzfläche vernachlässigbar war. Da sich ein die Probe tragendes Objektträgerglas weit unterhalb des herausgeschnittenen Gewebes (> 1 cm) befand, war die Reflexion von der Glasoberfläche vernachlässigbar. Daher stammte das vom Faserbündel erfasste Reflexionssignal hauptsächlich von der Oberfläche des Darmgewebes sowie von der distalen Seite der Faser selbst. In dieser Geometrie konnte das herkömmliche Endoskop im Kontaktmodus weder etwas sichtbar machen, noch den Hinweis auf die Existenz der Zotten (Abb. 5c). Dies liegt daran, dass das Reflexionssignal von der Oberfläche der Zotten aufgrund des geringen Indexunterschieds zwischen Gewebe und Wasser/Agarose-Gel vollständig durch das von der Faseroberfläche verdeckt wurde. Dies zeigt die Schwierigkeit, die endoskopische Bildgebung im Reflexionsmodus für biologische Gewebe zu realisieren. Im Gegenteil, unser holographisches Fourier-Endoskop konnte die äußeren Grenzen und die Morphologie der Zotten klar und kontrastreich visualisieren (Abb. 5d). Um das weite Sichtfeld abzudecken, bewegten wir die distale Spitze des Faserbündels und bildeten nacheinander mehrere Stellen der Zotten ab. Die aufgezeichneten Bilder wurden zusammengefügt, um das erweiterte Bild zu erzeugen. Aufgrund der Schärfe der Zottengrenzen wurde die räumliche Auflösung auf 2 μm geschätzt. Als Grundwahrheit wurde ein konfokales Reflexionsbild mit einem herkömmlichen Mikroskop unter Verwendung einer Luftobjektivlinse mit 0,4 NA bei einer Wellenlänge von 516 nm aufgenommen (Abb. 5b). Die Gesamtmorphologie der Zotten und ihrer Grenzen war fast identisch mit denen, die durch unser Endoskopbild aufgelöst wurden, was die Fähigkeit unseres Endoskops zur Abbildung von ungefärbtem Gewebe bestätigt. Es ist zu beachten, dass der Kontrast unseres Endoskopbilds aufgrund der unten erläuterten Hinzufügung des Kohärenz-Gatings etwas besser ist als der des herkömmlichen konfokalen Reflexionsbilds.

eine Beispielkonfiguration. Ein herausgeschnittenes Rattendarmgewebe wurde auf dickes Agarosegel (Dicke > 1 cm) auf einem Objektträger gelegt. Die distale Spitze des Faserbündels befand sich etwa 600 μm über der Gewebeoberfläche und ihr Spalt war mit Wasser gefüllt. b Konventionelles Reflexionsbild, aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung einer 0,4-NA-Objektivlinse bei der Wellenlänge von 516 nm. c Kontaktmodus-Reflexionsendoskopbild. d Holographisches Fourier-Endoskopbild. Maßstabsbalken: 100 μm.

In dieser Demonstration haben wir speziell eine Lichtquelle mit niedriger Kohärenz eingesetzt, um den Beitrag der Reflexion von der distalen Spitze des Faserbündels weiter abzuschwächen. Obwohl eine Einzelkernbeleuchtung mit Weitfelderkennung einen Großteil des Rückreflexionsrauschens eliminieren kann, gibt es immer noch Streureflexionen aufgrund des Austretens der Beleuchtung in die anderen Faserkerne. Selbst diese Streureflexionen können aufgrund des schwachen Kontrasts des Darmgewebes in Wasser/Agarosegel verheerende Auswirkungen auf die Bildrekonstruktion haben. Die Verwendung einer Quelle mit niedriger Kohärenz, deren Kohärenzlänge kürzer als der Abstand zwischen Spitze und Probe ist, kann diese Beiträge effektiv unterdrücken, da sie keine Interferenz mit dem Referenzstrahl verursachen können, dessen Weglänge auf die Gewebeprobe eingestellt wurde. Konkret wurde ein Ausgangsstrahl eines gepulsten Lasers (maßgefertigter Yb-Laser, Wellenlänge: 1032 nm) durch einen Prozess zur Erzeugung einer zweiten Harmonischen frequenzverdoppelt, um eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 516 nm und einer Bandbreite von 3 nm zu erzeugen. Dies entspricht der Kohärenzlänge von 20 μm. Für diese Messung wurde ein Faserbündel mit 300 μm Durchmesser (FIGH-06-300S) mit einer Länge von 15 cm und einer Kernzahl von ca. 4000 verwendet. Aufgrund der Dispersion durch die Abbildungsoptik und die Faserkerne wurde das effektive Kohärenz-Gating auf etwa 100 μm erweitert, was viel kürzer war als der typische Spalt von 600 μm zwischen der Faserspitze und der Gewebeoberfläche. Es stellte sich heraus, dass das Hinzufügen des Kohärenz-Gatings bei der Bildgebung von in Wasser und Agarosegel eingetauchten Geweben von entscheidender Bedeutung war. Unter einer Bedingung, bei der die Gewebeoberfläche Luft ausgesetzt ist, was normalerweise bei einer typischen endoskopischen Untersuchung der Fall ist, wird erwartet, dass der Bedarf an Kohärenz-Gating reduziert wird. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die markierungsfreie mikroskopische Bildgebungsfähigkeit unseres Endoskops möglicherweise dazu genutzt werden kann, die an der Oberfläche der Zotten auftretenden Anomalien in einem früheren Stadium als mit der derzeitigen Praxis zu erkennen.

Wir haben ein völlig flexibles, ultradünnes, linsenloses Endoskop entwickelt, das durch einen engen und gekrümmten Durchgang eine mikroskopische Abbildung von ungefärbtem biologischem Gewebe durchführen kann. Da das Faserbündel selbst als Endoskopsonde dient, ist das vorgeschlagene Verfahren möglichst dünn ausgestaltet. Der Durchmesser der Sonde betrug in der vorliegenden Studie entweder 350 μm oder 200 μm, er kann jedoch durch die Verwendung eines kleineren Faserbündels weiter reduziert werden. Daher kann der Durchmesser sogar mit der dünnsten Akupunkturnadel vergleichbar sein. Die erreichten lateralen und axialen Auflösungen betrugen 0,85 μm bzw. 14 μm, was mit denen hochauflösender Mikroskope vergleichbar ist. Die Aufnahme holographischer Bilder ermöglichte die Rekonstruktion von 3D-Objekten für ein Volumen, das einen Tiefenbereich von 400–1200 μm abdeckt, mithilfe einer einzigen Reflexionsmatrixaufnahme. Obwohl alle diese Vorteile erhalten bleiben, handelt es sich bei unserem Endoskop um einen flexiblen und nicht um einen starren Typ, da eine vorherige Kalibrierung der Bildgebungssonde nicht mehr erforderlich ist. Wir haben die komplexen kernabhängigen Phasenverzögerungen direkt aus den während der Bildgebungssitzung aufgenommenen Bildern gelöst, was es uns ermöglichte, die Endoskopsonde frei durch den interessierenden Bereich zu navigieren.

Die Aufnahmegeschwindigkeit für die volumetrische Bildgebung betrug 1 Hz bei Verwendung einer sCMOS-Kamera, da die erforderlichen komplexen Feldkarten nur 100 Bilder umfassen können. Die Bildgeschwindigkeit könnte allein durch den Einsatz einer Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera mit einer Bildrate von 2.000 Hz auf bis zu 20 Hz beschleunigt werden (siehe ergänzender Abschnitt 8). Durch diese Implementierung werden die Bewegungsartefakte während der Bildaufnahme erheblich reduziert. Die Bildrekonstruktion dauert 2 s, um Daten mit 200 Rohbildern auf einem Desktop-Computer zu verarbeiten (CPU: Intel Xeon Gold 6130, 2,10 GHz, RAM: 256 GB, GPU: NVIDIA TITAN RTX D6 24 GB). Wir gehen davon aus, dass der vollständige Ersatz von Matlab durch die kompilierte Programmiersprache wie C/C++ den Gesamtprozess deutlich schneller machen und die Echtzeitvisualisierung ermöglichen wird.

Die Möglichkeit der markierungsfreien und flexiblen endoskopischen Bildgebung mit der Leistungsfähigkeit der Mikroskopie könnte die nicht-invasive oder minimal-invasive Krankheitsdiagnose und industrielle Inspektionen beschleunigen. Unser Endoskop ist beispielsweise so dünn, dass es zur mikroskopischen Untersuchung durch enge Hohlräume wie die winzigen Atemwege der Lunge und enge Mikrogefäße eingeführt werden kann. Da die Sonde so dünn wie eine Akupunkturnadel sein kann, kann sie direkt in das Gehirngewebe eingeführt werden, um die neurologischen Störungen mit minimalen Komplikationen zu finden. Unser Endoskop kann auch eine präzise Phototherapie und eine effiziente Lichtstimulation ermöglichen, da das Behandlungslicht durch das Faserbündel abgegeben werden kann, während die endoskopische Bildgebung über dieselbe Bildgebungssonde auf die Zielläsion zugreift. Die vorgeschlagene Methode wurde mit der zeitgesteuerten Erkennung kombiniert, indem eine Lichtquelle mit niedriger Kohärenz zur besseren Reduzierung des Hintergrundrauschens eingesetzt wurde. Die zeitgesteuerte Erkennung ermöglicht die endoskopische Bildgebung tief im Gewebe sowie die Kartierung der oberflächlichen Morphologie. Da unser Ansatz einen besseren Bildkontrast liefern kann als die herkömmliche konfokale Reflexionsmikroskopie, wird diese Methode die Diagnose von Krankheiten, die tief im Gewebe auftreten, weiter beschleunigen16,45,46. Die Anwendbarkeit beschränkt sich nicht nur auf die medizinische Diagnose, sondern kann auch auf industrielle Inspektionen ausgeweitet werden. In modernen Halbleitern und Mikroprozessoren werden Geräte für maximale Integration in Schichten gestapelt. Unser Endoskop kann verwendet werden, um jeden Schritt des Herstellungsprozesses in den Kammern mit minimalen Eingriffen zu überwachen. Die Fähigkeit zur markierungsfreien Bildgebung ist besonders gut geeignet, da der Einsatz chemischer Färbemittel aufgrund der Bedenken hinsichtlich einer Kontamination der Geräte nicht wünschenswert ist.

Aus komplexen Bildern \({E}_{{{{{{\rm{Kamera}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}} ,{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{ {{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) in Abb. 2c haben wir die Reflexionsmatrix R konstruiert, in der die Spalten- und Zeilenindizes \(\left({u}_{ {{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) und \(\left({ u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\). Dies wurde erreicht, indem die einzelnen Bilder in Abb. 2c in Spaltenvektoren umgewandelt und zu einer Matrix zusammengefügt wurden. Wir identifizierten \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}}}}}^{{{{{\rm{c}}}}}}}\left({u} _{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) aus der Korrelation zwischen den Spalten und konstruierte eine korrigierte Matrix, in der die Matrixelemente \({E}^{{{{{\rm{c}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm {r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}} }}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)={e}^{-i{\phi }_{{{{{{\rm{ i}}}}}}}^{c}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{ i}}}}}}}\right)}{E}_{{{{{\rm{Kamera}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r }}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}} },{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\). Wir identifizierten dann \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{{{{\rm{c}}}}}}}\left({u }_{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) aus der Korrelation zwischen die Zeilen der korrigierten Matrix, die dann angewendet wurde, um die korrigierte Matrix zu konstruieren, deren Elemente \({E}^{{{{{\rm{c}}}}}}}\left({u}_{ {{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\ rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)={e}^{-i{\phi }_{{ {{{{\rm{i}}}}}}}^{c}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{ {{{{\rm{i}}}}}}}\right)}{E}_{{{{{{\rm{Kamera}}}}}}}\left({u}_{{{ {{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{ i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right){e}^{-i{\phi }_{{{{{ {\rm{r}}}}}}}^{c}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{ {\rm{r}}}}}}}\right)}\). Diese Prozesse wurden wiederholt, bis das Objektspektrum \({\widetilde{O}}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(\frac{k}{d}\left({ u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}+{u}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\right),\frac{k }{d}\left({v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}+{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}} \right)\right)\) wurde identifiziert42. Wir haben das Objektspektrum um \(\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}} verschoben }}}}\right)\) für einzelne Bilder, die das erfasste Spektrum in \({\widetilde{O}}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(\ frac{k}{d}{u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},\frac{k}{d}{v}_{{{{{{\rm{ r}}}}}}}\right)\) für alle Auswahlmöglichkeiten von Beleuchtungskernen. Diese Spektren wurden addiert und eine inverse Fourier-Transformation durchgeführt, um eine kohärent akkumulierte Objektfunktion \({O}_{M}\left(x,y\right)\) zu erhalten. \(\left|{O}_{M}\left(x,y\right)\right \vert=\left|O\left(x,y\right)\right|\) ist in den Abbildungen dargestellt. 2j und 2m. Einzelheiten zur Bildverarbeitung finden Sie im ergänzenden Abschnitt 2.

Herkömmliche Endoskopbilder, dargestellt in den Abb. 2h, k, 3c und 4a wurden aufgenommen, indem die Spitze des Faserbündels mit dem Auflösungsziel in Kontakt gebracht wurde. Dies entspricht dem Anbringen einer Linse mit 1-facher Vergrößerung an der Spitze einer Faser. In den Probenstrahlengang in Abb. 1a wurde eine Leuchtdiode (Modell: M530L3, Thorlabs, Wellenlänge: 530 nm) eingefügt, deren Ausgangsstrahl das gesamte Faserbündel beleuchtete. Reflektierte Bilder wurden mit derselben Kamera aufgenommen, die für unsere Endoskopbildgebung verwendet wurde.

Wir extrahierten Darmgewebe von 1 bis 2 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche SD-Ratten verwendet. Der obere Teil des Dünndarms wurde schnell herausgeschnitten und 2–4 Stunden lang bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach der Fixierung wurde das Darmgewebe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und dann zur Bildgebung mit Immersionsöl auf einen Objektträger montiert. Alle oben genannten experimentellen Verfahren und Protokolle wurden gemäß den Richtlinien des Ausschusses für Tierforschungspolitik der Korea University durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle relevanten Daten sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Die in dieser Arbeit verwendeten MATLAB-Codes sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch IBS-R023-D1, ein von der koreanischen Regierung finanziertes Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) (MSIT) (Nr. 2021R1A2C2012069), das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 des Europäischen Forschungsrates (ERC) (Stipendien-Nr . 677909, 101002406) und Israel Science Foundation (1361/18).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Wonjun Choi, Munkyu Kang.

Zentrum für molekulare Spektroskopie und Dynamik, Institut für Grundlagenwissenschaften, Seoul, Republik Korea

Wonjun Choi, Munkyu Kang, Jin Hee Hong und Wonshik Choi

Fachbereich Physik, Korea University, Seoul, Republik Korea

Wonjun Choi, Munkyu Kang, Jin Hee Hong und Wonshik Choi

Abteilung für Angewandte Physik, Selim und Rachel Benin School of Computer Science & Engineering, Hebräische Universität Jerusalem, Jerusalem, Israel

Ori Katz

Korea Electrotechnology Research Institute, Ansan, Korea

Byunghak Lee und Guang Hoon Kim

B2LAB Co., Ltd., Pohang-si, Gyeongsangbuk, Korea

Byunghak Lee

Abteilung für Bioingenieurwesen, Korea University, Seoul, Republik Korea

Youngwoon Choi

Interdisziplinäres Programm für Precision Public Health, Korea University, Seoul, Republik Korea

Youngwoon Choi

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Wonjun C., MK, OK, YC und Wonshik C. haben das Projekt konzipiert. Wonjun C. und MK entwarfen den Versuchsaufbau und führten die Experimente durch. Wonjun C., MK, YC und Wonshik C. analysierten Daten. JHH bereitete biologische Proben vor. BL- und GK-unterstütztes Lasersystem. Wonjun C., MK, YC und Wonshik C. haben das Manuskript vorbereitet und alle Autoren haben zur Fertigstellung des Manuskripts beigetragen. YC und Wonshik C. betreuten das Projekt. Wonjun C. und MK haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Korrespondenz mit Youngwoon Choi oder Wonshik Choi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Christophe Moser und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Choi, W., Kang, M., Hong, JH et al. Flexibles, ultradünnes holographisches Endoskop für die mikroskopische Abbildung ungefärbter biologischer Gewebe. Nat Commun 13, 4469 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32114-5

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Eingegangen: 16. Februar 2022

Angenommen: 18. Juli 2022

Veröffentlicht: 02. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32114-5

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